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    微生物樣品的處理方法
    點擊次數:33 發布日期:2019-3-8  來源:國家標準物質資源平臺
    微生物樣品的處理方法
    一、初級(初始)樣品混懸液
    樣品通過稱取一定重量后或量取一定體積后,加入9倍重量或體積的特定稀釋液,經過外力作用充分均質混勻后,得到懸濁液、溶液或者乳濁液。
    有的初始混懸液中含有較大的樣品顆粒時,應將其水平靜置沉淀。這樣得到的是初級(初始)混懸液(10-1)。
    二、次級十倍梯度稀釋
    取一特定體積的初級混懸液,加入9倍特定體積的稀釋液充分混勻,這樣就將初級混懸液進行了十倍稀釋操作(10-2),然后依次再進行下去(10-3,10-4....10-n),得到一系列的稀釋液,直至得到滿足目標微生物培養要求的稀釋液。這樣的操作叫次級十倍梯度稀釋,得到的一系列稀釋液被統稱為次級十倍梯度稀釋液。
    三、稀釋操作的原則
    初級混懸液的制備是為了讓樣品中的微生物盡可能均勻分布,然后在接下來的次級十倍梯度稀釋液中,微生物的數量能按指數進行均勻規則的遞減,這樣通過培養之后,方便用于菌落計數操作。
    為了嚴格每一個稀釋度的計數范圍,提高計數的準確性,應先對樣品的微生物污染程度做一次大體的評估,然后至少選取合適的兩個連續稀釋度的稀釋液,每個稀釋度至少接種兩個培養基平板進行培養。無論是初級樣品混懸液還是次級十倍梯度稀釋樣品溶液,都應振蕩均勻,保證其微生物在溶液中均勻分布之后再進行接下來的操作。
    振蕩時應該在渦旋混和器上進行(見圖)。用右手拇指和中指夾緊試管,右手食指抵住試管帽,防止振動時試管帽飛出,三個手指用力將試管底部頂住渦旋混和器的橡膠振動頭上。渦旋混和器運轉時通常有兩檔:一個是振動頭持續振動,一個是只有物品頂住振動頭才會振動,通常選用后者。如果沒有渦旋混和器,可以采用手心振動混勻的方法。
    四、稀釋液
    ⒈配制稀釋液的通常原則
    為了使結果更具可重復性,建議配制稀釋液時,無論用脫水的單種試劑逐一稱量配制還是使用脫水的商業成品培養基,實驗室人員在配制稀釋液時必須嚴格按照以下原則:
    (1)配制稀釋液的各種試劑或脫水成品培養基干粉一定要保證質量。
    (2)配制稀釋液的水必須是合格的蒸餾水,水的各項指標(pH、水活度、電導率、電阻率、菌落總數)必須符合培養基配制用水的要求。
    (3)稀釋液各組分必須充分溶解形成均一溶液,無沉淀。稀釋液配好之后, pH要滿足目標微生物的存活要求,特別是稀釋液經高壓滅菌之后的pH, pH誤差的正常范圍應在±0. 2 (25 ℃時)。
    ⒉普通稀釋液
    常用的普通稀釋液有濃度為0.1%、 pH6.8~7的滅菌蛋白胨水(按蛋白胨1.0g,氯化鈉8.5g,蒸餾水1000 mL的比例混和至完全溶解),磷酸鹽緩沖液, 0.85%的氯化鈉溶液, 2%的緩沖蛋白胨水等。有時會因具體情況加入一些添加劑,例如對于脂肪含量高的樣品會加入乳化劑、表面活性劑;對于均質操作時容易起泡沫的樣品會加入泡沫抑制劑、消泡劑等。
    在制備初級樣品溶液時,由于樣品的含量占整個溶液系統的比例較大,樣品可能會改變稀釋液的性質,特別當樣品中難溶于水的物質占較大比例時,樣品在稀釋液中的溶解度會受到影響。此時會影響到溶液的pH或者水活度(Aw),所以當無法確定樣品是否對稀釋液產生這種影響時,應測定第一個稀釋度的pH和水活度。可以在稀釋液中加入磷酸鹽緩沖液來穩定pH的變化。
    特別注意的是,對于一些高溶解度的干燥樣品(奶粉、嬰兒食品)制成初級樣品溶液時,水活度非常低,所以應選擇蒸餾水作為稀釋液。針對不同樣品,選擇最適合的稀釋液,這其實需要通過一系列的試驗得到,所選擇的稀釋液應該具有高的復蘇率。
    樣品的稀釋液制備過程,應該在30 min內完成。
    ⒊針對厭氧微生物的稀釋液
    對食品中厭氧微生物進行定性或定量檢測時,必須把氧化作用降到最低,稀釋液應具有抗氧化作用。制備樣品溶液時,應盡量避免氧氣進入。檢測對氧氣極其敏感的厭氧菌時,除了使用適當的稀釋液外,還要具備一些特殊設備作為輔助,比如用厭氧工作站來作為菌體的防護措施來操作。
    ⒋中和類稀釋液
    有些樣品中含有抑菌物質、消毒劑等殺滅或抑制微生物的成分。需要加入某些有機或無機化合物與這些成分作用進行中和,消除其影響。
    對于醇類與酚類消毒劑,稀釋液用普通營養肉湯即可;對于含氯消毒劑、含碘消毒劑、過氧化物消毒劑,需在稀釋液中加入0.1%硫代硫酸鈉;對于洗必泰、季銨鹽類消毒劑,需在稀釋液中加入3% (質量濃度)吐溫-80和0.3%卵磷脂;對于醛類消毒劑,需在稀釋液中加入0.3%甘氨酸;對于含有表面活性劑的各種復方消毒劑,需在稀釋液中加入3% (質量濃度)吐溫-80,以中和被檢樣液的殘效作用;
    針對大蒜泥、大蒜粒、大蒜粉、洋蔥粒等這類樣品,由于樣品中會含有抑制細菌生長的成分,可以采用D/E中和肉湯。
    ⒌嗜鹽菌、嗜滲菌稀釋液
    研究嗜鹽菌(如:食鹽樣品),應采用15%的無菌氯化鈉溶液作為稀釋液。嗜滲菌計數時,可以用20%的無菌蔗糖溶液作為稀釋液,這樣做的目的是為了保護菌體,因為普通的稀釋液對于這類菌來說,由于液體滲透壓過大,菌體會因液體的滲透作用膨脹破裂,導致菌體死亡無法進行培養和計數。這就需要與之相適應的無菌高滲溶液作為稀釋液,避免因滲透作用導致菌體死亡。
    五、稀釋液的分裝和滅菌
    將稀釋液分裝至適宜制備初級混懸液的容器內,容器體積應大小合適,不能太小,防止高壓滅菌時液體溢出。
    將稀釋液分裝至進行十倍梯度稀釋的試管內,一般每支試管裝9mL稀釋液,滅菌之后,每支試管內的稀釋液體積變化應在±2%以內。
    對某些微生物計數時,會用到一些不同的培養基,或許在分裝用于這些微生物的稀釋液(或其中一部分稀釋液)的體積遠大于9ml,這種情況下,裝這些稀釋液的試管或燒瓶應按實際的裝液量進行合理選擇。
    將裝好稀釋液的燒瓶或試管用配套的塞子塞好。一般稀釋液的高壓滅菌條件是121℃,15 min,
    應特別注意滅菌前后稀釋液的pH變化,某些稀釋液或培養基在滅菌之后, pH會降低。因為pH的變化對目標微生物的生物活性會造成影響,同時也是人工操作中很容易被忽視的一個環節,除了使用精度pH試紙以外,最好能配備一臺pH電子測量計,誤差為±0.1個pH單位之內。
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