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    如何正确制备微生物检测培养基
    点击次数:1135 发布日期:2019-3-7  来源:国家标准物?#39318;试?#24179;台
    如何正确制备微生物检测培养基
    微生物培养基的制备步骤总共分为九步,每一步是如何操作的呢?接下来小编就给大家细细分解一下。
    一、称取
    用精确度1/100的电子天平称取培养基所需药品。先根据配方计算出配制一定量培养基所需各种成分药品的量,然后用天平准确称取。称量时用称量纸折叠成簸箕?#35789;?#25918;药品。称量纸折叠方法如图所示。
    二、溶化
    培养基放入烧杯中,慢慢加入少量所需水,边加入边用玻棒搅拌。如果培养基中不含有琼脂,培养基不需要加热;如果含有琼脂,则需要用本生灯或电磁炉加热煮沸,完全溶解后,再补齐所需水,并搅拌均匀(如图3所示)。如果配制的培养基量很大,可用不锈钢锅加热溶化,?#19978;?#29992;温水加热并随时搅动,防止焦化,如有焦化现象,配制的培养基就不能使用,要重新配制。
    配制培养基时不可用铜或铁的容器溶化,因铜或铁制容器可能会使培养基中的铜和铁的含量超标,影响实验(培养基中铜含量大于0.3mg/L,细菌不宜生长,铁含量超过0.14mg/L,妨碍细菌产毒素)。?#21248;?#26131;发生反应,产生沉淀的药品,要分开溶解,zui后加入培养基,如磷酸氢二钾和硫酸镁。
    三、调pH
    虽然培养基中含有缓冲物质成分,能使培养基的pH尽可能的保持在要求的范围内,但是配出的培养基若不符合要求,就要进行必要的调整。如果有已校准pH计,可用pH计,如果没有,可用精密的pH试纸,再根据需要用1 mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸(微调可用0.1氢氧化钠或0.1mol/L盐酸)调制所需的pH。
    培基的pH一般为7.4~7.6,也有酸性或碱性的。用氢氧化?#39057;?#25972;的需要高压灭菌的培养基,在调整pH时要调至高出所需0.1个~0.2个单位,因用氢氧化?#39057;?#25972;时,高压灭菌后,培养基的pH要降低0.1~0.2。如培养基中含有碳酸钙成分,可不用调pH。
    四、过滤
    配成的培养基,若无特殊要求,可省?#28304;?#27493;。若有沉淀或浑浊需要澄清的液体培养基可用油纸过滤。而固体培养基可用中间夹一薄层脱脂棉的双层纱布过滤。如果过滤法?#20849;?#33021;达到澄清的要求,则可用蛋清澄清法,即培养基加热冷却到50~60℃,装入三角瓶内(不超过容量的二分之一),按1000mL加人1个~2个鸡蛋的蛋清,用力摇晃3-5min,高压蒸汽灭菌121℃、20min,取出趁热过滤即可。
    五、分装
    配制好的培养基根据不同的用途分装在三角瓶、试管?#28909;?#22120;中,分装试管,如果试管量很大,可用自动分液器,如果试管量少,可用漏斗分装。
    分装量不超过容器容积的三分之二。三角瓶以不超过容积的二分之一为宜;琼脂斜面以不超过试管长度的五分之一为宜,灭菌后,摆成的斜面为培养基量的三分之一,底层为三分之二的量为宜;半固体琼脂分装量为试管长度的三分之一;用来接种或保菌的高层琼脂,分装量为试管长度的四分之一或三分之一,用来接种厌氧菌的要达到三分之二;琼脂平板,内径为90mm的以13mL~15 mL为宜,内径70mm的平板为8mL~10 mL,制成的琼脂平板若表面水分较多,可将平板倒扣,放置在37℃培养箱内30min,干燥后再用。每批培养基应另外分装一小玻璃瓶(约20mL)与该批培养基同时灭菌,为测定该批培养基最终pH。
    六、灭菌
    分装好的培养基应立即进行灭菌。灭菌的方法种类如下:
    ?#22791;?#21387;蒸汽灭菌法
    大多耐热培养基都可用此法,小量分装时,用121℃,15min;灭菌量大时,用121℃,30min灭菌;含糖类的培养基只能113~115℃,15min灭菌,避免糖类遭破坏。
    ⒉煮沸灭菌法
    对含有不耐高温物?#23454;?#22521;养基,可使用此方法。
    ⒊过滤除菌
    以过滤的方法除菌,用无菌操作技术,定量加入培养基。血液、抗生素可用无菌操作技术抽取,加入冷却到50℃左?#19994;?#22521;养基中。培养基含有不耐热的物质时,可用此法。
    对LST培养基进行灭菌时,有时发酵管内会有气泡。为防止发酵管内产生气泡,可以采取以?#24405;?#39033;措施:
    ⒈小倒管浸满培养基(不留气泡)后再加入到盛LST的试管中。
    ⒉灭菌锅关闭放气阀前,将锅内气体排干净。
    ⒊试管塞不要塞得太紧(使用硅胶塞的时候),勿使用橡皮塞。
    ⒋不要过早打开灭菌锅,要等灭菌锅内气?#36141;?#28201;度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。
    如果以上情况都做?#20132;?#26377;气泡,可用水做培养基组的对照试验,若培养基组有气泡,而对照组没有气泡可确定是培养基自身的原因。
    七、倒平板
    灭菌融化的培养基冷却到50℃后,倒入无菌干燥的培养皿中。培养基的温度不能过高,否则容易在培养皿的内盖上形?#21830;?#22810;的冷凝水;温度太低,培养基又容易凝?#22363;?#22359;,无法制成平板。
    倒平板时,应在靠近酒精灯火焰进行,以免外界的杂菌落入平板内,左手拿培养皿,右手拿三角瓶的底部,用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下,灼烧瓶口,用大拇指和食指把培养皿盖打开一条缝,至瓶口刚好伸入,倒入培养基,以铺满底为限,不超过培养皿高度的三分之一,迅速盖好盖,放在桌面上,轻轻地转动培养皿,使培养基分布均匀,冷凝后即可。
    八、摆斜面
    装在试管中的琼脂培养基,在灭菌完成后,趁热立即摆放在木棒(或玻璃棒)上,并成?#23454;?#30340;斜度,冷却后,琼脂凝?#30899;?#25104;斜面。斜面长度不用超过试管二分之一。
    九、质量检查
    培养基灭菌后仔细检查一遍,发现有破?#36873;?#27700;分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染,都要丢弃,不能再用。并测定其最终pH。还需进行无菌检查和效果检查。无菌检查是将灭菌后的培养基取1管(瓶)~2管(瓶),37℃恒温培养1d~2d,确定无杂菌生长;效果检查是用标准菌株接种在相关的培养基上检查检查菌的生长、形态及生化情况,与已知情况相符。两种情况都?#32454;瘢?#37197;制的培养基方可使用。
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